臺灣農藥科學第四期電子書

56 臺灣農藥科學 第 4 期 化所得 DNA 樣品存放於 -20 ℃ 冰箱，待 進行聚合酶連鎖反應。 以植物菌質體廣效性引子對 P1/P7 (5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT- 3’/5’-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3’) 對長 豇豆罹病組織進行第一次聚合酶連鎖反應 (26) 。聚合酶連鎖反應總體積為 20 µL ，其 中包含 1 倍反應緩衝液 (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.01% gelatin, 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100) 、 250 µM 的 dNTPs 、 0.5 µM 的引子、 0.8 Units 的 ProTaq™ DNA Polymerase (Protech Technology Enterprise Co. Ltd., Taipei, Taiwan) 及 20 ng 基因體 DNA 。聚合酶連 鎖反應增幅條件先以 94 ℃ 反應 30 sec ， 之後進行 94 ℃ 2 min 、 55 ℃ 1 min 、 72 ℃ 90 sec ，共 35 個循環，最後再進行 72 ℃ 7 min 。第一次聚合酶連鎖反應所得產物 稀釋 10 倍後，再以 R16F2n / R16R2 (5’- GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’/5’- TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCg- 3’) (21) 進行巢氏聚合酶連鎖反應 (nested polymerase chain reaction) ，其方法及增幅條 件與上述相同，以得到 F2nR2 序列片段。 增幅後之產物以 1% agarose (1 倍 TAE buffer) 之電泳分析 (100V) ，並以 1 Kb DNA ladder H3 RTU (GeneDireX Inc. 5348 Vegas Dr. Las Vegas City, Nevada 89108, USA.) 作為核酸標誌物，最後以溴 化釔錠染色觀察，並照相記錄。 將聚合酶連鎖反應所得 16S rRNA 序 列片段經純化後，將序列片段送至明欣生 物 科 技 公 司 以 自 動 定 序 儀 (Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 進行定序。將 定序所得之 16S rDNA 序列送至 NCBI (National Center for Biotechnology Infor- mation ，美國國家生物科技資料中心 ) 的 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 進行序列比對。 四、親緣關係探討 將得到的 16S rDNA 序列與登錄於 GenBank ( 基因庫 ) 之不同菌系序列進行 比較，本實驗所參考的植物菌質體菌系包 括： 9 個來自國外感染豇豆的植物菌質體 菌系及 17 個感染其他寄主且屬於不同 16S rRNA 分群之模式菌株 ( 表一 ) ，另以 Acholeplasma laidlawii (GenBank accession number : FJ655561) 之 16S rDNA 序列作 為外群。所有序列以 BioEdit 7.0.9.0 版 (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA, USA) 軟 體 ClustalW (14) ，進行多序列比對並整理 得到一致性序列後，再以 DNA 序列分析 軟體 Molecular Evolution Genetic Analysis (MEGA) version 7.0 (19) 套用 Jukes cantorr 模式，計算序列間之遺傳距離，並以最大 似然法 (Maximum Likelihood) 方法繪製 親緣關係樹狀圖，以 1000 次重複取樣之 bootstrap replications 值以檢驗親緣關係樹 狀圖各支點的可信度 (13,18) ，比較各不同菌 系之親緣性。