臺灣農藥科學第四期電子書

臺灣長豇豆花器葉化菌質體 55 鏡觀察等方式進行診斷；鑑定則依據病徵 及寄主範圍、媒介昆蟲種類、血清學 … 等 特性來進行分析。然而植物菌質體的寄主 範圍甚廣，同一作物可能受多種植物菌質 體複合感染，且不同植物菌質體所造成的 病徵相似，因此上述的分類方式缺乏一致 性 (28) 。直到 1998 年 Lee 等人依據植物菌 質體的 16S rRNA 基因序列及 F2nR2 序 列 片 段 之 限 制 酵 素 片 段 長 度 多 型 性 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 作為分群依據，截至 2016 年為 止，植物菌質體菌系可被區分成 33 個主 要菌群 (21,29,37) 。 目前臺灣較重要的植物菌質體病害包 括一條根簇葉病、梨衰弱病、木瓜莖頂病 葉枯萎病、花生簇葉病、絲瓜簇葉病、甘 藷簇葉病、泡桐簇葉病、日日春葉片黃化 病、水稻黃萎病、甘蔗白葉病、洛神捲葉 及 花 器 葉 化 症 、 長 梗 紫 麻 簇 葉 病 等 (1,4,6,7,31,32) 。本文為首次報導臺灣地區長豇 豆花器葉化症之致病因子並探討其 16S rRNA 特性，再更進一步分析比較與其他 國家長豇豆菌質體菌系間親緣相關性。 材料與方法 一、植物樣本來源及病害發生調查 2015 年 7 月於雲林縣水林鄉的田區 發現長豇豆植株呈現花器葉化、葉片叢 生、葉片黃化且明顯變小等病徵，且全株 病徵呈現系統性分布，與植物菌質體所引 起之病徵相似，採集同一田區之罹病及正 常植株，並將採集的樣本保存於 4 ℃ 冰 箱。同年於屏東縣長豇豆產區進行病害調 查，調查區域涵蓋長治鄉、鹽埔鄉及內埔 鄉等 3 鄉鎮共計 10 區栽植園。 二、穿透式電子顯微鏡觀察 切取罹病長豇豆花器葉化之葉柄組 織，以陳與劉氏等人的方式加以修改進行 樣品固定與脫水 (3) ：先以 2.5% 戊二醛 (glutaraldehyde) 及 1% 四氧化鋨 (osmium tetroxide) 行雙重固定後，以丙酮系列脫 水，並進行樹脂包埋，包埋後的樣品以超 薄切片機進行切片，最後以飽和醋酸鈾 (uranyl acetate) 及 0.2% 檸檬酸鉛雙重染 色後，置於銅網上以穿透式電子顯微鏡 (JEM-1010, JEOL, Japan) 觀察。 三、總量 DNA 萃取及巢氏聚合 酶連鎖反應檢測 取罹病植株花器葉化及正常植株之葉 柄組織以酒精消毒表面後，切取 100 mg 組織樣本放入研磨袋，並加入 1mL SCPAP 緩衝液 (0.1% disodium succinate, 0.1% trisodium citrate, 0.15% K 2 HPO 4 , 0.1% KH 2 PO 4 , 0.02 M sodium ascorbate, and 5% acid-washed insoluble polyvinylpyrolidone, pH7.0) 進行研磨後，再利用組織與細胞 基因體 DNA 純化試劑盒 (GeneMark, Tai- chung, Taiwan) 萃取植物總量 DNA ，純