臺灣農藥科學第四期電子書

58 臺灣農藥科學 第 4 期 五、植物菌質體之 16SrRNA 分群 將上述所得之 16SrDNA 序列輸入 i Phyclassifier 網站，網站會與資料庫中的 模式菌株之進行 16SrDNA 序列比對，並 計算其核酸序列相同度 (identities) 。若其 相同度高於 97.5% ，則表示該菌株為模式 菌株之相關菌株。 i Phyclassifier 網站亦可 電腦模擬 17 種限制酵素 ( Alu I, Bam HI, Bfa I, Bst UI ( Tha I), Dra I, Eco RI, Hae III, Hha I, Hin fI, Hpa I, Hpa II, Kpn I, Mbo I ( Sau 3AI), Mse I, Rsa I, Ssp I and Taq I) 於其 F2nR2 區間序列進行酶切作用 (21) ，並比對 分析所得到的片段。其分析公式 F = 2 Nxy / ( Nx + Ny ) ，是以 X 及 Y 兩種不同的 植物菌質體經上述 17 種酵素酶切所得之 總片段數 ( Nx 及 Ny ) 與兩種植物菌質體 所共有的酶切片段數 ( Nxy ) 之比例，得 到相似係數 (similarity coefficient, F) ，來 作為分群依據 (33) 。相似係數大於或等於 0.98 ，可視為同一亞群；若相似係數小於 0.85 ，則歸屬於不同群。 結果 一、病害之發生、病徵與調查 2015 年 7 月於雲林縣水林鄉首次發 現長豇豆罹病株呈現花器葉化、葉片叢 生、葉片黃化且明顯變小等病徵 ( 圖 一 ) ，與植物菌質體所引起之病徵相似。 調查罹病園及其鄰近園區，未發現其他罹 病園區，而該罹病園區之發生率為 4% ， 罹病株呈現零星點狀分布，罹病株之花器 葉化病徵呈現系統性分布，罹病株幾無產 量。同年於屏東縣長治鄉、鹽埔鄉及內埔 鄉共調查 10 區長豇豆田區，亦未發現罹 病園區。爾後 2016 年及 2017 年分別於嘉 義縣太保市及南投縣竹山鎮亦發現長豇豆 花器葉化之病徵，以 P1/P7 廣效性引子對 進行聚合酶連鎖反應確認為植物菌質體感 染。經實地調查發現太保之罹病園區之病 害發生率為 4~5% ，其罹病株皆分布於園 區邊緣區域；竹山罹病園區之病害發生率 高達 50% ，而罹病株平均分布於整個園 區。 二、穿透性電子顯微鏡觀察 長豇豆罹病樣本花器葉化組織之葉柄 以穿透性電子顯微鏡觀察，可以發現其維 管束組織篩管細胞中有植物菌質體存在 ( 圖二 ) 不 ，且呈現大小 一致之形態，而健 康之長豇豆組織之篩管細胞並無植物菌質 體存在。 三、聚合酶連鎖反應檢測鑑定 利用植物菌質體廣效性引子對 P1/P7 進行第一次聚合酶連鎖反應，目標為增幅 植物菌質體之 16S-23S rDNA 序列，片段 大小約為 1.8 Kb 。結果發現三個罹病樣本 皆可增幅出符合預計大小的 DNA 片段，