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臺灣農藥科學 第
1
期
130
tomato
、
P. syringae
pv.
tabaci
及
P. syringae
pv.
phaseolicola
等為對照菌株
(
對照菌株
DNA
由國立中興大學植物病理學系細菌研究室
提供
)
。培養供試菌株之菌液至
10
8
cfu/mL
濃度，使用組織與細胞基因體
DNA
純化試
劑盒
(GeneMark, Taichung, Taiwan)
萃取基因
體
DNA
，再各取
2 ul
作為
DNA
模版。根
據
P. syringae
pv.
antirrhini
的
16S-23S inter-
genic transcribed spacer (ITS)
序列
(25)
，設計
引子對
Pse-ITS-F (5
’
-agaagcagcttttgctttgc-3
’
)
及
Pse-ITS-R (5
’
-ccgaaagtttgcatttcaca-3
’
)
進
行
PCR
分析以鑑定供試菌株。
PCR
反應總
體積為
20 ul
，其中包含
1
倍反應緩衝液
(10
mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.01% gela-
tin, 1.5 mM MgCl
2
, 0.1% Triton X-100)
、
250
uM
的
dNTPs
、
0.5 uM
的引子、
0.8 Units
的
ProTaq
TM
DNA Polymerase (Protech Technol-
ogy Enterprise Co., Ltd., Taipei, Taiwan)
及
20
ng
基因體
DNA
。
PCR
增幅條件先以
94
°
C
反應
5 min
，之後進行
94
°
C 1 min
、
58
°
C 1
min
、
72
°
C 1 min
，共
35
個循環，最後再進
行
72
°
C 10 min
。增幅後之產物以
1% aga-
rose (1
倍
TAE buffer)
之電泳分析
(100 V)
，
並以
100 bp DNA ladder H3 RTU (GeneDireX
Inc., 5348 Vegas Dr. Las Vegas City, Nevada
89108, USA)
作為核酸標幟物，最後以溴化
乙錠染色觀察，並照相記錄。
八、
16S-23S ITS
定序
選取
Cc24
、
Cc30
及
Cc39
經
PCR
反應
所得
16S-23S ITS
序列片段經由純化後，以
轉殖套件
pOSI-T PCR Cloning kit (GeneMark,
Taichung, Taiwan)
來進行
DNA
片段之轉殖。
抽取轉殖株的質體，並進行
PCR
及限制酵
素切割確認轉殖片段後，將序列片段送至明
欣生物科技公司以自動定序儀
(Applied Bio-
systems 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher
Scientific Inc., USA)
進行定序。將定序所
得之
16S-23S ITS
序列送至
NCBI (National
Center for Biotechnology Information
，美國
國家生物科技資料中心
)
的
BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool)
進行序列比對。
九、親緣關係鑑定
將得到的
16S-23S ITS
序列與
17
種登錄
於
GenBank (
基因庫
)
之
P. syringae
不同病
原型
(
表一
)
的序列進行比較，本實驗所參
考的病原型包括：
P. syringae
pv.
maculicola
、
P. syringae
pv.
morsprunorum
、
P. syringae
pv.
lachrymans
、
P. syringae
pv.
tomato
、
P. syringae
pv.
passiflorae
、
P. syringae
pv.
actinidiae
、
P.
syringae
pv.
antirrhini
、
P. syringae
pv.
delphi-
nii
、
P. syringae
pv.
coronafaciens
、
P. syringae
pv.
porri
、
P. syringae
pv.
garcae
、
P. syringae
pv.
syringae
、
P. syringae
pv.
tagetis
、
P. syringae
pv.
helianthi
、
P. syringae
pv.
aptata
、
P. syringae
pv.
pisi
及
P. syringae
pv.
tabaci
(19)
。所有序列以
BioEdit 7.0.9.0
版
(Ibis Biosciences, Carlsbad,
CA, USA)
軟體
ClustalW
(13)
，進行多序列比對
並整理得到一致性序列後。再以
DNA
序列
分析軟體
Molecular Evolution Genetic Analysis
(MEGA) version 4.0
(30)
套 用
Kimura 2-param-