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茼蒿細菌性葉斑病
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以注射接種法接種於萬國士菸草
(
Nicotiana
tabacum
)
葉片內，置於室溫
24 h
觀察是否
有過敏性反應。
四、病原性測定
接種試驗所使用的供試植株為普遍栽
培的「大葉茼蒿」，於西螺種子行所購買
茼蒿種子，其種子來源為農友自行留種。
以
1%
稀鹽酸種子消毒
20 min
、流水沖洗
2
次，再將種子浸泡於清水後播種於穴盆中。
植株高約
10 cm
時進行接種試驗，分別選取
Cc13
、
Cc22
、
Cc24
、
Cc30
、
Cc37
及
Cc39
等
6
個菌株進行病原菌測定，配置
10
8
cfu/mL
之細菌懸浮液，以噴霧方式分別接種於茼
蒿葉面及葉背，置於溫室中的霧室
(mist
chamber)
進行保濕，試驗期間之溫度為
15 ~
27
°
C
，觀察並記錄病徵出現情形，再從接
種後罹病茼蒿組織分離出病原菌，以符合
柯霍式法則。
五、細菌型態觀察及生理生化測
定
將培養於
NA
平板培養基
1 d
之供試菌
株，加入少許無菌水
5 s
後，輕輕吸起滴於
載玻片上，加入
0.5%
醋酸鈾醯，兩分鐘後
以覆有
formvar
支持膜之銅網沾取，再以濾
紙吸乾多餘水分，置於
JEM-1010 (Jeol Korea
Ltd., Seoul, Korea)
穿透式電子顯微鏡觀察細
菌型態及鞭毛。選取前述
6
個菌株作為供試
菌株，分別培養於
NA
平板培養基後，依據
Braun-Kiewnick
(7)
及
Schaad
等學者
(27)
所編
著之植物病原細實驗指南所述，進行葛蘭
氏染色
(Gram staining)
、
King
’
s B
培養基
(18)
上螢光色素
(fluorescent pigment)
形成、果
聚醣
(levan production)
測定、精氨酸二水
解酶
(arginine dihydrolase production)
測定、
硝酸還原酶
(nitrate reductase)
測定、馬鈴
薯致腐測試
(potato soft rot)
及菸草過敏性反
應
(tobacco hypersensitivity)
；碳源利用上，
包含蔗糖
(sucrose)
、鼠李糖
(L-rhamnose)
、
海藻糖
(trehalose)
、甘露醇
(manitol)
、香葉
醇
(geraniol)
、苯甲酸
(benzoate)
、纖維二
糖
(cellobiose)
、山梨糖醇
(sorbitol)
、酒石酸
(tartrate)
及阿拉伯糖
(D-arabinose)
等醣類。
六、
Biolog Identification System
鑑定
以前述
6
個菌株作為供試菌株，分別
重複劃線培養於
BUG Agar
培養基中約
16 ~
24 h
，重複劃線於
BUG Agar
培養基，將細
菌懸浮於
GN Inoculation Fluid (0.4% NaCl,
0.03% pluronic F-68, 0.01% gellan gum)
中，
調整濁度至
52% T (turbidity)
，分別取
150 ul
細菌懸浮液加入
Biolog GN2
反應盤
(Biolog
Inc., Hayward, CA)
中，置於
28
°
C
下培養
4
~ 24 h
後以光譜儀測讀，接著透過
Biolog
鑑
定系統之
GN2
資料庫
(Biolog 6.1
版
)
進行
比對判讀，鑑定其種、屬。
七、
PCR
檢測鑑定
選取前述
6
個菌株作為供試菌株，並
選 取
P. syringae
pv.
syringae
、
P. syringae
pv.