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抗嘉磷塞雜草之變異與鑑定
73
ha
嘉磷塞，抗性植株噴施
0
、
0.82
、
1.64
、
3.28
、
6.56
、
13.12
及
26.24 kg a.e./ha
，各處理
6
重覆。施藥方式以二氧化碳加壓噴藥器穩
壓
(30 psi)
噴施嘉磷塞，噴嘴為
Teejet 8002
型號，移動速率為
0.5 m/sec
。施藥後
14
日
稱取繖花龍吐珠地上部乾重，以
log-logistic
公式
(32)
估算抗
(R)
及感性
(S)
繖花龍吐珠
50%
抑制率之嘉磷塞劑量
(ED
50
)
值。
三、測定嘉磷塞噴施繖花龍吐珠
後之莽草酸
(Shikimic Acid)
含量變化
根據劑量反應分析之結果，選用對嘉磷
塞抗性最強及最敏感生物型，分別採收單株
種子，於溫室經播種育苗，植株約
12 ~ 15
葉齡，噴施
0.82 kg a.e./ha
嘉磷塞次致死劑
量，施藥後第
0
、
2
、
4
、
6
、
8
及
10
日採集
幼葉，進行莽草酸含量測定。參考
Singh et
al. (1998)
之方法
(35)
，取
3 g
幼葉以液態氮磨
碎，添加
15 mL 0.25 N HCl (1:3, w/v)
反應
30
分鐘，以
15,000
g
離心
15
分鐘，取上層液
再以
15,000
g
離心
5
分鐘，之後取上層液
50
μ
L
添加
0.5 mL 1%
過碘酸
(periodic acid)
，於
室溫下靜置
3 h
，添加
0.5 mL 1N NaOH
、
0.3
mL 0.1 M glycine
，於波長
380 nm
測定吸光
量，並估算莽草酸含量
(
μ
mol/g)
。
四、抗及感性繖花龍吐珠
EPSPS
之基因選殖
於前述方法
2
的藥劑劑量反應結果，
選取對嘉磷塞具有明顯差異的抗及感性生
物型單一植株，各稱取
0.5 g
新生幼葉，利
用
TRIzol
商品萃取總
RNA
，貯存於
-70
℃
備用。依據
NCBI GenBank
中
EPSPS cDNA
序列，設計
EPSPS-F1
及
EPSPS-R1
引子組
(
表一
)
，利用反轉錄聚合酶鏈反應
(RT-PCR)
其中
PCR
之煉合溫度為
55
℃
1 min
，預估
增幅約
1,100 bp
的
EPSPS DNA
片段。利用
gel extraction kit
將
DNA
從膠體中溶洗出，
轉殖於大腸桿菌
(
Escherichia coli
) DH5
α
菌
表一、本研究於繖花龍吐珠
EPSPS
基因選殖及檢測使用之引子
Table 1.
Primers used in the cloning and detection of
Hedyotis corymbosa
EPSPS
Primers
DNA sequence (5’
→
3’)
Amplified DNA (bp)
(1)
EPSPS-F1
AACAGTGATGATGTTCATTACATGCTTG
1,156
EPSPS-R1
GCAAGAGAGAAAGCCATGGCCATCCTG
(2)
EPSPS-F2
ATGGCACAAGCTATTCAAGCCCTTC
1,551
EPSPS-R2
ATGCTTTGAGACCCTTTTAAGGACA
(3)
R-EPSPS-5
ATTGTTGCTTGGAGCATGAAGC
350
R-EPSPS-3
TCACAACCAAGCTGCTTAAGCCC
(4)
EPSPS-D1
CATTACATGCTTGGTGCCTTGAG
495
EPSPS-D2
TCACAACCAAGCTGCTTAAGCCCA