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臺灣農藥科學 第
1
期
74
株，抽取
plasmid DNA
，證實
plasmid DNA
長度為
1,100 bp
，即進行解序及序列比
對，確證此
1,100 bp PCR
產物為
EPSPS
基
因，再於已知序列中設計
GSP-1
：
ACGGC-
CAGAGTCATGGCAACATCTGGCA
及
GSP-
2
：
TGGCGTTCCTAGAATGCGTGAGC-
GACCCA
引子組，進行
Rapid amplification
of cDNA ends (RACE)
全長
cDNA
增幅，煉
合溫度為
68
℃
30 s
，依據
Clontech
公司推
薦之操作流程，再經由
EPSPS-F2
及
EPSPS-
R2 (
表一
)
兩端引子，以煉合溫度為
68
℃
30 s
，針對增幅全長
EPSPS cDNA
及定序。
五、測定嘉磷塞噴施繖花龍吐珠
後之
EPSPS
酵素活性
利用
RT-PCR
增幅繖花龍吐珠抗性及感
性生物型之
EPSPS cDNA
，經轉殖於大腸桿
菌
(
E. coli
)
大量複製，純化的
EPSPS
進行酵
素活性測試，
EPSPS
酵素活性分析是利用
孔雀石綠法
(malachite green dye method)
，
經 由
EPSPS
酵 素 與
phosphoenol pyruvate
(PEP)
及
shikimic-3-phosphate (S3P)
受質結
合之後，合成
EPSP
及釋出磷酸根，由磷酸
根的釋出含量估算酵素的活性
(25)
。將純化
的
EPSPS
蛋白分別加入
0
、
0.001
、
0.01
、
0.1
、
1
及
10 mM
嘉磷塞，再加入反應液
(
含
終 濃 度 分 別 為
50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-
1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)
、
1 mM S3P
、
1 mM PEP
，
pH
調 整 為
7.0)
，
使最終反應體積為
50
μ
L
。置於
28
℃下反
應
5 min
，加入
800
μ
L
孔雀綠─鉬酸銨呈色
溶液
(malachite green-ammonium molybdate
colorimetric solution)
， 再 於
1 min
後 加 入
800
μ
L 34%
檸檬酸鈉
(sodium citrate)
停止呈
色反應，室溫下放置
30 min
後，測定於波
長
660 nm
的吸光度。空白對照組為不添加
S3P
的反應。
六、利用單核苷酸多型性
(Single
Nucleotide Polymorphism,
SNP)
及聚合酶鎖反應─限
制性片段長度多型性分析
(PCR-RFLP)
分子標誌技術，
檢測抗性繖花龍吐珠
(
一
) SNP
方法：參考
Delye et al. (2002)
之方法，比對抗性牛筋草及瑞士黑麥草
EPSPS
的胺基酸序列，於第
178
位置的脯氨
酸
(proline)
變異為絲氨酸
(serine)
的核酸序
列，即利用抗及感性繖花龍吐珠
EPSPS
基
因於第
532
鹼基胸腺嘧啶
(thymine)
及胞嘧
啶
(cytosine)
之差異，設計
R-EPSPS-5
及
R-
EPSPS-3
引子組
(
表一
)
，進行單核苷酸多
型性技術的核測，煉合溫度為
70
℃
10 s
，
循環
30
週期，預估可於抗性檢體增幅出
350 bp EPSPS
片段。
(
二
) PCR-RFLP
分子標誌技術：利用
抗及感性繖花龍吐珠
EPSPS
基因序列具有
Hae
III
限制酶之差異，取約
20
μ
g
繖花龍吐
珠的基因組
DNA
，以
EPSPS-D1/EPSPSP-D2
引子分別增幅
495 bp
的部分
EPSPS
，取
2
μ
L PCR
產物，添加
1
μ
L
Hae
III
限制酶及
2
μ
L buffer
及
15
μ
L
無菌去離子水，總體積為